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非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范

非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范

本规范适用于非洲猪瘟病毒流行毒株与非洲瘟病毒CD2v和MGF 360-505R基因缺失株的荧光PCR方法鉴别检测。

1.  主要试剂

1.1  核酸提取试剂盒。

1.2  无核酸酶水。

1.3  荧光PCR预混液(2×)。

1.4  引物和探针:P72、CD2v、MGF360-505R基因扩增引物和探针由国家非洲猪瘟参考实验室设计并提供。

1.5 阳性和阴性对照:阳性对照样品为ASFV基因组DNA标准物质(用无核酸酶水稀释1000倍后使用),由国家非洲猪瘟参考实验室提供;阴性对照样品为无核酸酶水。

2.  主要仪器设备

2.1 荧光PCR扩增仪。

2.2 台式低温高速离心机。

2.3 组织匀浆机。

2.4 微量可调移液器(2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同规格)。

2.5 无核酸酶离心管与吸头。

2.6  PCR扩增管。

3.  样品采集和运输保存

    对活猪,可采集抗凝全血(EDTA抗凝)、口鼻拭子或血清等;对病死猪或已屠宰猪,可采集脾脏、淋巴结、扁桃体、肝脏等组织。尽快送至实验室进行病毒核酸检测。

    样品的运送与保存应满足NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》相关要求。上述样品可在4°C最长保存2天;如需长时间保存,应置于-20°C以下。

4.  样品处理

4.1  组织样品

    取0.1 g~0.2 g样品,加入1 mL~2 mL预冷的PBS(pH 7.4),用组织匀浆机高速匀浆,制成10%组织匀浆液,以5000 r/min离心10 min,取200 μL上清液进行核酸提取。

4.2  液体样品

抗凝全血、血清等液体样品不需进行特殊处理,直接取200 μL进行核酸提取。

5.  病毒核酸的提取和纯化

    取已进行前处理的样品200 μL,可按传统方法提取病毒核酸,也可采用病毒核酸提取试剂盒、自动化核酸提取仪提取病毒核酸。提取后的病毒核酸应立即使用或置于-20°C以下冷冻保存。每次抽提核酸,应包括一个阳性对照样品和一个阴性对照样品。

6.  荧光PCR检测

6.1  荧光PCR反应液制备

    在灭菌的离心管中制备符合检测样品数量(包括阳性、阴性对照)要求的荧光PCR反应混合液,至少额外制备两个样品的量。每个样品配制20 µL PCR反应混合液,组成如下:7.5 mL P72、CD2v、MGF360-505R基因引物、探针预混液(P72、CD2v、MGF360-505R基因探针分别用FAM、VIC和Cy5进行标记)、12.5 mL 2×探针法荧光PCR预混液。

    分别取20 µL PCR反应混合液加至每个PCR扩增管中;再分别取5 µL DNA模板加入到PCR扩增管中。每次进行荧光PCR扩增时均应设立阳性、阴性对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板,阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板。加入模板后,密封PCR扩增管,瞬时离心。将所有PCR扩增管放在荧光PCR仪中。按下述条件运行扩增程序。

6.2  荧光PCR扩增条件

    50°C孵育2min;95°C预变性5min;95°C变性15s,60°C退火延伸1min,45个循环,在每一循环的60°C时收集FAM、VIC和Cy5通道中的荧光信号。

6.3  结果分析

    Ct值由荧光PCR仪的软件自动确定。

6.3.1  试验成立条件

    阳性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因的Ct值均<35且出现特异性扩增曲线,阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因无Ct值或阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因Ct值≥40且无特异性扩增曲线,判为试验有效。试验无效时应重新进行试验。

6.3.2  P72、CD2v、MGF 360-505R基因检测结果判定

6.3.2.1 P72基因检测结果判定(FAM通道)

    被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线,判为ASFV P72基因检测阳性;无Ct值或Ct值≥40,判为ASFV P72基因检测阴性;38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线,判为疑似。对疑似样品,再进行1次复检,做3个重复;至少2个重复Ct值<40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV P72基因检测阳性,否则判为ASFV P72基因检测阴性。

6.3.2.2  CD2v基因检测结果判定(VIC通道)

    被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线,判为ASFV CD2v基因检测阳性;无Ct值或Ct值≥40,判为ASFV CD2v基因检测阴性;38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线,判为疑似。对疑似样品,再进行1次复检,做3个重复;至少2个重复Ct值<40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV CD2v基因检测阳性,否则判为ASFV CD2v基因检测阴性。

6.3.2.3  MGF 360-505R基因检测结果判定(Cy5通道)

    被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线,判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性;无Ct值或Ct值≥40,判为ASFV MGF 360-505R基因检测阴性;当38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线,判为疑似。对疑似样品,再进行1次复检,做3个重复;至少2个重复Ct值<40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性,否则判为ASFV MGF 360-505R基因检测阴性。

6.3.3  综合判定

结合P72、CD2v、MGF 360-505R等3个基因的检测结果进行综合判定。具体判定标准见附表。

附表                         综合判定标准

综合判定结果

检测结果

P72-FAM

CD2v-VIC

MGF-Cy5

ASFV流行株阳性

+

+

+

ASFV CD2v基因缺失株阳性

+

-

+

ASFV MGF基因缺失株阳性

+

+

-

ASFV CD2v与MGF基因双缺失株阳性

+

-

-

ASFV阴性

-

-

-

注:“+”代表检测阳性;“-”代表检测阴性



信息来源:荆州市动物疫病预防控制中心 | 发布时间:2021-03-24 08:27


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