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非洲猪瘟ct值对照表

非洲猪瘟ct值对照表

准备检测样品

    取0.1 g~0.2 g样品,加入1 mL~2 mL预冷的PBS(pH 7.4),用组织匀浆机高速匀浆,制成10%组织匀浆液,以5000 r/min离心10 min,取200 μL上清液进行核酸提取。


荧光PCR检测:

1.1  荧光PCR反应液制备

    在灭菌的离心管中制备符合检测样品数量(包括阳性、阴性对照)要求的荧光PCR反应混合液,至少额外制备两个样品的量。每个样品配制20 µL PCR反应混合液,组成如下:7.5 mL P72、CD2v、MGF360-505R基因引物、探针预混液(P72、CD2v、MGF360-505R基因探针分别用FAM、VIC和Cy5进行标记)、12.5 mL 2×探针法荧光PCR预混液。

    分别取20 µL PCR反应混合液加至每个PCR扩增管中;再分别取5 µL DNA模板加入到PCR扩增管中。每次进行荧光PCR扩增时均应设立阳性、阴性对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板,阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板。加入模板后,密封PCR扩增管,瞬时离心。将所有PCR扩增管放在荧光PCR仪中。按下述条件运行扩增程序。

1.2  荧光PCR扩增条件

    50°C孵育2min;95°C预变性5min;95°C变性15s,60°C退火延伸1min,45个循环,在每一循环的60°C时收集FAM、VIC和Cy5通道中的荧光信号。

3.3  结果分析

    Ct值由荧光PCR仪的软件自动确定。

1.3.1  试验成立条件

    阳性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因的Ct值均<35且出现特异性扩增曲线,阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因无Ct值或阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因Ct值≥40且无特异性扩增曲线,判为试验有效。试验无效时应重新进行试验。

1.3.2  P72、CD2v、MGF 360-505R基因检测结果判定

1.3.2.1 P72基因检测结果判定(FAM通道)

    被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线,判为ASFV P72基因检测阳性;无Ct值或Ct值≥40,判为ASFV P72基因检测阴性;38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线,判为疑似。对疑似样品,再进行1次复检,做3个重复;至少2个重复Ct值<40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV P72基因检测阳性,否则判为ASFV P72基因检测阴性。

1.3.2.2  CD2v基因检测结果判定(VIC通道)

    被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线,判为ASFV CD2v基因检测阳性;无Ct值或Ct值≥40,判为ASFV CD2v基因检测阴性;38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线,判为疑似。对疑似样品,再进行1次复检,做3个重复;至少2个重复Ct值<40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV CD2v基因检测阳性,否则判为ASFV CD2v基因检测阴性。

1.3.2.3  MGF 360-505R基因检测结果判定(Cy5通道)

    被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线,判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性;无Ct值或Ct值≥40,判为ASFV MGF 360-505R基因检测阴性;当38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线,判为疑似。对疑似样品,再进行1次复检,做3个重复;至少2个重复Ct值<40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性,否则判为ASFV MGF 360-505R基因检测阴性。

1.3.3  综合判定

结合P72、CD2v、MGF 360-505R等3个基因的检测结果进行综合判定。具体判定标准见附表。

附表                         综合判定标准

综合判定结果

检测结果

P72-FAM

CD2v-VIC

MGF-Cy5

ASFV流行株阳性

+

+

+

ASFV CD2v基因缺失株阳性

+

-

+

ASFV MGF基因缺失株阳性

+

+

-

ASFV CD2v与MGF基因双缺失株阳性

+

-

-

ASFV阴性

-

-

-

注:“+”代表检测阳性;“-”代表检测阴性


   阳性和阴性对照:阳性对照样品为ASFV基因组DNA标准物质(用无核酸酶水稀释1000倍后使用),由国家非洲瘟参考实验室提供;阴性对照样品为无核酸酶水。


附录B(资料性附录)非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列

  • 1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA

  • 61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT

  • 121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT

  • 181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT

  • 241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT

  • 301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT

  • 361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC

  • 421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT

  • 481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC

  • 541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA

  • 601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA

  • 661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT

  • 721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT

  • 781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT

  • 841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC

  • 901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT

  • 961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC

  • 1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG

  • 1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT

  • 1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA

  • 1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC

  • 1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA

  • 1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA

  • 1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT

  • 1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC

  • 1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA

  • 1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT

  • 1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT

  • 1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG

  • 1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA

  • 1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG

  • 1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT

附录C(规范性附录)非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照

C.1阳性对照

阳性对照制备方法:人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段,序列参见附录B,将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72,使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L,保存于-20℃备用。

C.2 阴性对照

阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。

附录D(规范性附录)实时荧光PCR反应液配方

实时荧光PCR反应液配方见表D.1。

表D.1 实时荧光PCR反应液配方

组 分

1个检测体系的加入量

2×PCR 缓冲液a

12.5μL

dNTP(2.5 mmol/L)

1.0 μL

上游引物(10 μmol/L)

1.0 μL

下游引物(10 μmol/L)

1.0μL

探针(10 μmol/L)

1.0 μL

Taq 酶b(5U/μL)

0.5μL

去离子水

3μL

总体积

20μL

2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。

Taq 酶b:具有5’→3’外切活性。


附录 E(资料性附录)非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考

图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。

图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图

(资料来源:中国兽医协会)



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